El 21 de agosto de 1911, el carpintero italiano Vincenzo Peruggia (exempleado del Museo del Louvre) llegó al Museo del Louvre a las 7 de la mañana, vestido con un blusón de trabajo blanco como los utilizados por el personal de mantenimiento del museo, descolgó el cuadro y a continuación, en la escalera Visconti, separó la tabla de su marco, abandonando este último. A continuación salió del museo con el cuadro escondido bajo su ropa, que colocó posteriormente en una valija. Cuando poco después el pintor Louis Béroud entró a la sala para ver el cuadro notó su ausencia y avisó de inmediato a la policía. El museo permaneció cerrado durante una semana para proceder a la investigación.
Unos años antes el museo había sufrido el robo de otras varias piezas, lo cual hizo suponer a la policía que ambos acontecimientos estaban relacionados. Guillaume Apollinaire y Pablo Picasso se convirtieron en sospechosos puesto que se los había relacionado con la desaparición de unas piezas de escultura del museo, además de por unas declaraciones en las que Apollinaire apoyaba la propuesta formulada por el futurista Marinetti de quemar los museos para dejar paso al nuevo arte. Posteriormente se demostró que ambos eran inocentes. Al mismo tiempo que se realizaban las investigaciones sobre el robo, se capturó al aventurero belga Honoré-Joseph Géry Pieret, quien confesó ser el autor de otro robo acaecido en 1906, pero no del de La Gioconda.
Durante la ausencia de la obra, se batió el record de visitantes al museo; acudían a apreciar el hueco dejado en la pared por el cuadro que había sido hurtado.
La pintura fue recuperada dos años y ciento once días después del robo, tras la captura de Peruggia. El detenido intentó vender el cuadro original al director de la Galleria degli Uffizi de Florencia, Alfredo Geri, quien se hizo acompañar de la policía. Peruggia alegó que su intención era devolver la obra a su verdadera patria, y que él sólo era víctima de un estafador; los tribunales de justicia lo condenaron a un año y quince días de prisión que luego redujeron a siete meses y nueve días1 Antes de regresar al museo, la pintura se exhibió en Florencia, Roma y Milán.
En 1932, el periodista Karl Decker publicó una información según la cual el autor intelectual del robo habría sido un comerciante argentino llamado Eduardo Valfierno, que habría fallecido en 1931, con el fin de vender seis copias falsas, e incluso proporcionó los nombres de los presuntos coleccionistas estafados, pero la verosimilitud de este relato no pudo ser probada